Javascript està actualment desactivat al vostre navegador.Quan javascript està desactivat, algunes funcions d'aquest lloc web no funcionaran.
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Departament de Ciència, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Catalunya, Espanya * Aquests autors tenen algunes idees sobre aquest treball Equal antecedents de la contribució: l'àcid hialurònic (HA) és un polisacàrid d'origen natural que s'utilitza en la producció de farcits dèrmics amb finalitats estètiques.Com que té una vida mitjana de diversos dies en els teixits humans, els farcits dèrmics basats en HA es modifiquen químicament per allargar la seva vida al cos.La modificació més comuna en els farcits comercials basats en HA és l'ús d'1,4-butanediol diglicidil èter (BDDE) com a agent de reticulació per reticular les cadenes de HA.El BDDE residual o no reaccionat es considera no tòxic a <2 parts per milió (ppm);per tant, s'ha de quantificar el BDDE residual en el farciment dèrmic final per garantir la seguretat del pacient.Materials i mètodes: Aquest estudi descriu la detecció i caracterització d'un subproducte de la reacció de reticulació entre BDDE i HA en condicions alcalines mitjançant la combinació de cromatografia líquida i espectrometria de masses (LC-MS).Resultats: Després de diferents anàlisis, es va comprovar que les condicions alcalines i l'alta temperatura utilitzades per desinfectar l'hidrogel HA-BDDE van afavorir la formació d'aquest nou subproducte, el compost "similar al propilenglicol".L'anàlisi LC-MS va confirmar que el subproducte té la mateixa massa monoisotòpica que el BDDE, un temps de retenció diferent (tR) i un mode d'absorbància UV diferent (λ = 200 nm).A diferència del BDDE, es va observar en l'anàlisi LC-MS que en les mateixes condicions de mesura, aquest subproducte té una taxa de detecció més alta a 200 nm.Conclusió: aquests resultats indiquen que no hi ha epòxid a l'estructura d'aquest nou compost.La discussió està oberta per avaluar el risc d'aquest nou subproducte que es troba en la producció d'hidrogel HA-BDDE (farciment dèrmic HA) amb finalitats comercials.Paraules clau: àcid hialurònic, farciment dèrmic HA, àcid hialurònic reticulat, BDDE, anàlisi LC-MS, subproducte BDDE.
Els farcits a base d'àcid hialurònic (HA) són els farcits dèrmics més comuns i populars utilitzats amb finalitats cosmètiques.1 Aquest farciment dèrmic és un hidrogel, generalment compost per> 95% d'aigua i 0,5-3% HA, que els dóna una estructura semblant a un gel.2 HA és un polisacàrid i el component principal de la matriu extracel·lular dels vertebrats.Un dels ingredients.Consisteix en unitats disacàrids repetides d'àcid (1,4)-glucurònic-β (1,3)-N-acetilglucosamina (GlcNAc) connectades per enllaços glicosídics.Aquest patró de disacàrids és el mateix en tots els organismes.En comparació amb alguns farcits basats en proteïnes (com el col·lagen), aquesta propietat fa que l'HA sigui una molècula altament biocompatible.Aquests farcits poden presentar una especificitat de seqüència d'aminoàcids que pot ser reconeguda pel sistema immunitari del pacient.
Quan s'utilitza com a farciment dèrmic, la principal limitació de l'HA és la seva ràpida rotació dins dels teixits a causa de la presència d'una família específica d'enzims anomenats hialuronidases.Fins ara, s'han descrit diverses modificacions químiques en l'estructura de l'HA per augmentar la vida mitjana de l'HA als teixits.3 La majoria d'aquestes modificacions intenten reduir l'accés de la hialuronidasa als polímers de polisacàrids mitjançant la reticulació de cadenes HA.Per tant, a causa de la formació de ponts i dels enllaços covalents intermoleculars entre l'estructura de l'HA i l'agent de reticulació, l'hidrogel d'HA reticulat produeix més productes de degradació anti-enzim que l'HA natural.4-6
Fins ara, els agents de reticulació químics utilitzats per produir HA reticulat inclouen metacrilamida, 7 hidrazida, 8 carbodiimida, 9 divinil sulfona, 1,4-butanediol diglicidil èter (BDDE) i poli (etilenglicol) diglicidil èter.10,11 BDDE és actualment l'agent de reticulació més utilitzat.Tot i que durant dècades s'ha demostrat que aquests tipus d'hidrogels són segurs, els agents de reticulació utilitzats són reactius reactius que poden ser citotòxics i, en alguns casos, mutagènics.12 Per tant, el seu contingut residual a l'hidrogel final ha de ser elevat.El BDDE es considera segur quan la concentració residual és inferior a 2 parts per milió (ppm).4
Hi ha diversos mètodes per detectar la concentració de BDDE de baix residu, el grau de reticulació i la posició de substitució en hidrogels HA, com ara cromatografia de gasos, cromatografia d'exclusió de mida juntament amb espectrometria de masses (MS), mètodes de mesura de fluorescència de ressonància magnètica nuclear (RMN) i Cromatografia líquida d'alt rendiment acoblada amb matriu de díodes (HPLC).13-17 Aquest estudi descriu la detecció i caracterització d'un subproducte en l'hidrogel final d'HA reticulat produït per la reacció de BDDE i HA en condicions alcalines.HPLC i cromatografia líquida-espectrometria de masses (anàlisi LC-MS).Com que es desconeix la toxicitat d'aquest subproducte de BDDE, recomanem que la quantificació de residus s'ha de determinar d'una manera similar al mètode que s'acostuma a fer amb BDDE en el producte final.
La sal de sodi obtinguda d'HA (Shiseido Co., Ltd., Tòquio, Japó) té un pes molecular de ~ 1.368.000 Da (mètode Laurent) 18 i una viscositat intrínseca de 2,20 m3/kg.Per a la reacció de reticulació, es va comprar BDDE (≥95%) a Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EUA).La solució salina tamponada amb fosfat amb pH 7,4 es va comprar a Sigma-Aldrich Company.Tots els dissolvents, l'acetonitril i l'aigua utilitzats en l'anàlisi LC-MS es van comprar de qualitat HPLC.L'àcid fòrmic (98%) es compra com a grau de reactiu.
Tots els experiments es van realitzar en un sistema UPLC Acquity (Waters, Milford, MA, EUA) i es van connectar a un espectròmetre de masses triple quadrupol API 3000 equipat amb una font d'ionització electrospray (AB SCIEX, Framingham, MA, EUA).
La síntesi d'hidrogels de HA reticulats es va iniciar afegint 198 mg de BDDE a una solució de hialuronat de sodi (NaHA) al 10% (p/p) en presència d'àlcali a l'1% (hidròxid de sodi, NaOH).La concentració final de BDDE a la barreja de reacció va ser de 9,9 mg/ml (0,049 mM).A continuació, la barreja de reacció es va barrejar i homogeneïtzar a fons i es va deixar continuar a 45 ° C durant 4 hores.19 El pH de la reacció es manté a ~12.
A continuació, es va rentar la barreja de reacció amb aigua i l'hidrogel final HA-BDDE es va filtrar i es va diluir amb tampó PBS per aconseguir una concentració d'HA de 10 a 25 mg/ml i un pH final de 7,4.Per esterilitzar els hidrogels de HA reticulats produïts, tots aquests hidrogels es passen a autoclau (120 °C durant 20 minuts).L'hidrogel BDDE-HA purificat s'emmagatzema a 4 ° C fins a l'anàlisi.
Per analitzar el BDDE present en el producte HA reticulat, es va pesar una mostra de 240 mg i es va introduir al forat central (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, EUA; volum 0,5 ml) i es va centrifugar a 10.000 rpm a temperatura ambient. 10 minuts.Es van recollir i analitzar un total de 20 µL de líquid desplegable.
Per analitzar l'estàndard BDDE (Sigma-Aldrich Co) en condicions alcalines (1%, 0,1% i 0,01% NaOH), si es compleixen les condicions següents, la mostra líquida és 1:10, 1:100 o fins a 1:1.000.000 Si cal, utilitzeu aigua desionitzada MilliQ per a l'anàlisi.
Per als materials de partida utilitzats en la reacció de reticulació (HA 2%, H2O, 1% NaOH i 0,049 mM BDDE), es va analitzar 1 ml de cada mostra preparada a partir d'aquests materials utilitzant les mateixes condicions d'anàlisi.
Per determinar l'especificitat dels pics que apareixen al mapa d'ions, es van afegir 10 µl de solució estàndard de BDDE de 100 ppb (Sigma-Aldrich Co) a la mostra de 20 µl.En aquest cas, la concentració final de l'estàndard en cada mostra és de 37 ppb.
Primer, prepareu una solució d'estoc de BDDE amb una concentració d'11.000 mg/L (11.000 ppm) diluint 10 μL de BDDE estàndard (Sigma-Aldrich Co) amb 990 μL d'aigua MilliQ (densitat 1,1 g/mL).Utilitzeu aquesta solució per preparar una solució de BDDE de 110 µg/L (110 ppb) com a dilució estàndard intermèdia.A continuació, utilitzeu el diluent estàndard BDDE intermedi (110 ppb) per preparar la corba estàndard diluint el diluent intermedi diverses vegades per aconseguir la concentració desitjada de 75, 50, 25, 10 i 1 ppb.Com es mostra a la figura 1, es troba que la corba estàndard BDDE d'1,1 a 110 ppb té una bona linealitat (R2>0,99).La corba estàndard es va repetir en quatre experiments independents.
Figura 1 Corba de calibratge estàndard BDDE obtinguda per anàlisi LC-MS, en la qual s'observa una bona correlació (R2>0,99).
Abreviatures: BDDE, 1,4-butanediol diglicidil èter;LC-MS, cromatografia líquida i espectrometria de masses.
Per identificar i quantificar els estàndards BDDE presents a l'HA reticulat i els estàndards BDDE a la solució base, es va utilitzar l'anàlisi LC-MS.
La separació cromatogràfica es va aconseguir en una columna LUNA 2,5 µm C18(2)-HST (50 × 2,0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, EUA) i es va mantenir a temperatura ambient (25 ° C) durant l'anàlisi.La fase mòbil està formada per acetonitril (dissolvent A) i aigua (solvent B) que conté un 0,1% d'àcid fòrmic.La fase mòbil s'elueix mitjançant elució gradient.El gradient és el següent: 0 minuts, 2% A;1 minut, 2% A;6 minuts, 98% A;7 minuts, 98% A;7,1 minuts, 2% A;10 minuts, 2% A. El temps de funcionament és de 10 minuts i el volum d'injecció és de 20 µL.El temps de retenció de BDDE és d'uns 3,48 minuts (que oscil·la entre 3,43 i 4,14 minuts segons els experiments).La fase mòbil es va bombejar a un cabal de 0, 25 ml/min per a l'anàlisi LC-MS.
Per a l'anàlisi i quantificació de BDDE per MS, el sistema UPLC (Waters) es combina amb un espectròmetre de masses triple quadrupol API 3000 (AB SCIEX) equipat amb una font d'ionització electrospray, i l'anàlisi es realitza en mode d'ions positius (ESI+).
Segons l'anàlisi del fragment d'ions realitzada a BDDE, es va determinar que el fragment amb la intensitat més alta era el fragment corresponent a 129, 1 Da (figura 6).Per tant, en el mode de monitorització multi-ió (MIM) per a la quantificació, la conversió de massa (relació massa-càrrega [m/z]) de BDDE és de 203,3/129,1 Da.També utilitza el mode d'exploració completa (FS) i el mode d'exploració d'ions de producte (PIS) per a l'anàlisi LC-MS.
Per tal de verificar l'especificitat del mètode, es va analitzar una mostra en blanc (fase mòbil inicial).No es va detectar cap senyal a la mostra en blanc amb una conversió de massa de 203,3/129,1 Da.Pel que fa a la repetibilitat de l'experiment, es van analitzar 10 injeccions estàndard de 55 ppb (al mig de la corba de calibratge), donant lloc a una desviació estàndard residual (RSD) <5% (dades no mostrades).
El contingut de BDDE residual es va quantificar en vuit hidrogels HA reticulats de BDDE autoclaus diferents, corresponents a quatre experiments independents.Tal com es descriu a la secció "Materials i mètodes", la quantificació s'avalua pel valor mitjà de la corba de regressió de la dilució estàndard BDDE, que correspon al pic únic detectat a la transició de massa BDDE de 203,3/129,1 Da, amb una retenció. temps de 3,43 a 4,14 minuts Sense esperar.La figura 2 mostra un cromatograma d'exemple de l'estàndard de referència BDDE de 10 ppb.La taula 1 resumeix el contingut de BDDE residual de vuit hidrogels diferents.El rang de valors és d'1 a 2,46 ppb.Per tant, la concentració residual de BDDE a la mostra és acceptable per a ús humà (<2 ppm).
Figura 2 Cromatograma iònic de l'estàndard de referència BDDE de 10 ppb (Sigma-Aldrich Co), transició MS (m/z) obtinguda per anàlisi LC-MS de 203,30/129,10 Da (en mode MRM positiu).
Abreviatures: BDDE, 1,4-butanediol diglicidil èter;LC-MS, cromatografia líquida i espectrometria de masses;MRM, monitorització de reaccions múltiples;MS, massa;m/z, relació massa-càrrega.
Nota: Les mostres 1-8 són hidrogels HA reticulats BDDE autoclaus.També s'informa de la quantitat residual de BDDE a l'hidrogel i el pic del temps de retenció de BDDE.Finalment, també s'informa de l'existència de nous pics amb diferents temps de retenció.
Abreviatures: BDDE, 1,4-butanediol diglicidil èter;HA, àcid hialurònic;MRM, monitorització de reaccions múltiples;tR, temps de retenció;LC-MS, cromatografia líquida i espectrometria de masses;RRT, temps de retenció relatiu.
Sorprenentment, l'anàlisi del cromatograma iònic LC-MS va mostrar que, basant-se en totes les mostres d'hidrogel HA reticulats a l'autoclau analitzades, hi va haver un pic addicional al temps de retenció més curt de 2,73 a 3,29 minuts.Per exemple, la figura 3 mostra el cromatograma iònic d'una mostra de HA reticulat, on apareix un pic addicional en un temps de retenció diferent d'aproximadament 2,71 minuts.Es va trobar que el temps de retenció relativa (RRT) observat entre el pic recentment observat i el pic de BDDE era de 0, 79 (taula 1).Com que sabem que el pic recentment observat es manté menys a la columna C18 utilitzada en l'anàlisi LC-MS, el nou pic pot correspondre a un compost més polar que el BDDE.
Figura 3 Cromatograma iònic de mostra d'hidrogel HA reticulat obtinguda per LC-MS (conversió de massa MRM 203,3/129,0 Da).
Abreviatures: HA, àcid hialurònic;LC-MS, cromatografia líquida i espectrometria de masses;MRM, monitorització de reaccions múltiples;RRT, temps de retenció relatiu;tR, temps de retenció.
Per descartar la possibilitat que els nous pics observats puguin ser contaminants originalment presents a les matèries primeres utilitzades, aquestes matèries primeres també es van analitzar mitjançant el mateix mètode d'anàlisi LC-MS.Els materials de partida analitzats inclouen aigua, 2% NaHA en aigua, 1% NaOH en aigua i BDDE a la mateixa concentració que s'utilitza en la reacció de reticulació.El cromatograma iònic del material de partida utilitzat no mostrava cap compost ni pic, i el seu temps de retenció correspon al nou pic observat.Aquest fet descarta la idea que no només el material de partida pot contenir compostos o substàncies que puguin interferir amb el procediment d'anàlisi, sinó que no hi ha indicis de possible contaminació creuada amb altres productes de laboratori.Els valors de concentració obtinguts després de l'anàlisi LC-MS de BDDE i nous pics es mostren a la taula 2 (mostres 1-4) i el cromatograma iònic a la figura 4.
Nota: Les mostres 1-4 corresponen a les matèries primeres utilitzades per produir hidrogels HA reticulats BDDE autoclaus.Aquestes mostres no van ser autoclaus.
Abreviatures: BDDE, 1,4-butanediol diglicidil èter;HA, àcid hialurònic;LC-MS, cromatografia líquida i espectrometria de masses;MRM, monitorització de reaccions múltiples.
La figura 4 correspon al cromatograma LC-MS d'una mostra de la matèria primera utilitzada en la reacció de reticulació d'HA i BDDE.
Nota: tots aquests es mesuren a la mateixa concentració i proporció utilitzada per dur a terme la reacció de reticulació.Els números de les matèries primeres analitzades pel cromatograma corresponen a: (1) aigua, (2) solució aquosa d'HA al 2%, (3) solució aquosa de NaOH a l'1%.L'anàlisi LC-MS es realitza per a una conversió de massa de 203,30/129,10 Da (en mode MRM positiu).
Abreviatures: BDDE, 1,4-butanediol diglicidil èter;HA, àcid hialurònic;LC-MS, cromatografia líquida i espectrometria de masses;MRM, monitorització de reaccions múltiples.
Es van estudiar les condicions que van portar a la formació de nous cims.Per tal d'estudiar com les condicions de reacció utilitzades per produir l'hidrogel HA reticulat afecten la reactivitat de l'agent de reticulació BDDE, donant lloc a la formació de nous pics (possibles subproductes), es van realitzar diferents mesures.En aquestes determinacions, es va estudiar i analitzar el reticulant BDDE final, que es va tractar amb diferents concentracions de NaOH (0%, 1%, 0,1% i 0,01%) en un medi aquós, seguit d'autoclau o sense.El procediment de bacteris per simular les mateixes condicions és el mateix que el mètode utilitzat per produir l'hidrogel HA reticulat.Tal com es descriu a la secció "Materials i mètodes", la transició massiva de la mostra es va analitzar per LC-MS a 203,30/129,10 Da.Es calculen el BDDE i la concentració del nou pic, i els resultats es mostren a la taula 3. No s'han detectat pics nous a les mostres que no van ser autoclaus, independentment de la presència de NaOH a la solució (mostres 1-4, taula). 3).Per a mostres autoclaus, només es detecten nous pics en presència de NaOH a la solució, i la formació del pic sembla dependre de la concentració de NaOH a la solució (mostres 5-8, taula 3) (RRT = 0,79).La figura 5 mostra un exemple de cromatograma iònic, que mostra dues mostres autoclaus en presència o absència de NAOH.
Abreviatures: BDDE, 1,4-butanediol diglicidil èter;LC-MS, cromatografia líquida i espectrometria de masses;MRM, monitorització de reaccions múltiples.
Nota: El cromatograma superior: la mostra es va tractar amb una solució aquosa de NaOH al 0,1% i es va autoclau (120 ° C durant 20 minuts).Cromatograma inferior: la mostra no es va tractar amb NaOH, sinó que es va autoclauar en les mateixes condicions.La conversió de massa de 203,30/129,10 Da (en mode MRM positiu) es va analitzar mitjançant LC-MS.
Abreviatures: BDDE, 1,4-butanediol diglicidil èter;LC-MS, cromatografia líquida i espectrometria de masses;MRM, monitorització de reaccions múltiples.
En totes les mostres autoclaus, amb o sense NaOH, la concentració de BDDE es va reduir molt (fins a 16, 6 vegades) (mostres 5-8, taula 2).La disminució de la concentració de BDDE pot ser deguda al fet que a altes temperatures, l'aigua pot actuar com a base (nucleòfil) per obrir l'anell epoxid de BDDE per formar un compost 1,2-diol.La qualitat monoisotòpica d'aquest compost és diferent de la del BDDE i, per tant, no es veurà afectada.LC-MS va detectar un canvi de massa de 203,30/129,10 Da.
Finalment, aquests experiments mostren que la generació de nous pics depèn de la presència de BDDE, NAOH i del procés d'autoclau, però no té res a veure amb l'HA.
El nou pic trobat a un temps de retenció d'aproximadament 2,71 minuts es va caracteritzar per LC-MS.Amb aquest propòsit, es va incubar BDDE (9, 9 mg/ml) en una solució aquosa de NaOH a l'1% i es va estendre a l'autoclau.A la taula 4, les característiques del nou pic es comparen amb el pic de referència conegut BDDE (temps de retenció aproximadament 3,47 minuts).A partir de l'anàlisi de fragmentació iònica dels dos pics, es pot concloure que el pic amb un temps de retenció de 2, 72 minuts mostra els mateixos fragments que el pic BDDE, però amb intensitats diferents (figura 6).Per al pic corresponent al temps de retenció (PIS) de 2, 72 minuts, es va observar un pic més intens després de la fragmentació a una massa de 147 Da.A la concentració de BDDE (9, 9 mg/mL) utilitzada en aquesta determinació, també es van observar diferents modes d'absorbància (UV, λ = 200 nm) en l'espectre ultraviolat després de la separació cromatogràfica (figura 7).El pic amb un temps de retenció de 2,71 minuts encara és visible a 200 nm, mentre que el pic BDDE no es pot observar al cromatograma en les mateixes condicions.
Taula 4 Resultats de caracterització del nou pic amb un temps de retenció d'uns 2,71 minuts i el pic BDDE amb un temps de retenció de 3,47 minuts
Nota: Per obtenir aquests resultats, es van realitzar anàlisis LC-MS i HPLC (MRM i PIS) als dos pics.Per a l'anàlisi HPLC, s'utilitza la detecció UV amb una longitud d'ona de 200 nm.
Abreviatures: BDDE, 1,4-butanediol diglicidil èter;HPLC, cromatografia líquida d'alt rendiment;LC-MS, cromatografia líquida i espectrometria de masses;MRM, monitorització de reaccions múltiples;m/z, relació massa-càrrega;PIS, producte Escaneig iònic;llum ultraviolada, llum ultraviolada.
Nota: els fragments de massa s'obtenen mitjançant anàlisi LC-MS (PIS).Cromatograma superior: espectre de masses de fragments de mostra estàndard BDDE.Cromatograma inferior: l'espectre de masses del nou pic detectat (RRT associat al pic BDDE és 0,79).El BDDE es va processar en una solució de NaOH a l'1% i es va estendre a l'autoclau.
Abreviatures: BDDE, 1,4-butanediol diglicidil èter;LC-MS, cromatografia líquida i espectrometria de masses;MRM, monitorització de reaccions múltiples;PIS, exploració d'ions de producte;RRT, temps de retenció relatiu.
Figura 7 Cromatograma iònic de l'ió precursor de 203,30 Da i (A) el nou pic amb un temps de retenció de 2,71 minuts i (B) la detecció UV del pic estàndard de referència BDDE a 3,46 minuts a 200 nm.
En tots els hidrogels HA reticulats produïts, es va observar que la concentració residual de BDDE després de la quantificació de LC-MS era <2 ppm, però va aparèixer un nou pic desconegut a l'anàlisi.Aquest nou pic no coincideix amb el producte estàndard BDDE.El producte estàndard BDDE també s'ha sotmès a la mateixa anàlisi de conversió de qualitat (conversió MRM 203,30/129,10 Da) en el mode MRM positiu.En general, altres mètodes analítics com la cromatografia s'utilitzen com a proves límit per detectar BDDE en hidrogels, però el límit màxim de detecció (LOD) és lleugerament inferior a 2 ppm.D'altra banda, fins ara, s'han utilitzat RMN i MS per caracteritzar el grau de reticulació i/o modificació de l'HA en els fragments d'unitat de sucre dels productes HA reticulats.L'objectiu d'aquestes tècniques mai ha estat quantificar la detecció de BDDE residual a concentracions tan baixes com la que descrivim en aquest article (LOD del nostre mètode LC-MS = 10 ppb).
Hora de publicació: 01-set-2021